依诺生物构建了酶与蛋白质的制备与合成能力,实现了T7 RNA聚合酶、DNase I、BspQ I、RNase Inhibitor、无机焦磷酸酶等mRNA生产所需要的全部工具酶以及各类蛋白质标准品的制备和生产,满足客户mRNA药物开发最基本的关键酶原料和研究及质量分析参比样品需求。在此基础上,依诺生物建立了机器学习和传统酶定向进化相结合的酶设计平台,满足客户各类个性化的酶设计和定制生产需求,同时通过定向进化开发了一系列性能优异的新型自主知识产权工具酶以帮助客户进一步从源头优化制药工艺。
T7 RNA聚合酶作为一步法合成mRNA的关键工具酶,可以使用帽类似物作为起始碱基一步法合成含有Cap的mRNA,是影响mRNA合成质量和成本的关键因素之一。常规T7 RNA聚合酶热稳定性较差,其在37℃以上长时间反应后会逐渐失活,且由于焦磷酸和磷酸等副产物的抑制作用,mRNA的产量远达不到理论极限值。同时常规T7 RNA聚合酶具有RNA依赖的RNA聚合酶活性,从而在IVT合成mRNA时,还会产生少量的双链RNA(dsRNA)。dsRNA会引起人强烈的免疫反应,是mRNA制药过程中需要通过额外的纯化步骤去除的关键杂质11。产生的dsRNA越多,纯化工艺越复杂,mRNA质量控制难度越高从而生产成本越高。另外,不同结构的帽类似物与T7 RNA聚合酶的亲和力存在差异,常规T7 RNA聚合酶与一些特定结构帽类似物亲和力较低从而导致合成的mRNA加帽率下降,影响mRNA药物质量或需要增加额外纯化成本。
依诺生物通过机器学习和定向突变相结合的方法,运用不同的帽类似物对T7 RNA聚合酶进行突变筛选,针对高加帽率、减少dsRNA的产生、提升产量和耐热性进行定向进化,开发了通用适配传统Cap及Cap2类似物、具有高加帽率、低dsRNA、及耐高温的高产特性的T7 RNA聚合酶突变体。该突变体针对通用传统Cap类似物以及依诺生物自主知识产权Cap2类似物RHCaps的加帽率均在95%以上,且热稳定性大幅提升,在50℃条件下活性最高可达到野生型(WT)在37℃活性的2.5倍,IVT产量显著提升,并高于市售耐高温的T7 RNA聚合酶, 产生dsRNA的量仅为WT的25%。